| |
第一节 病毒的形态结构与功能
病毒是以其致病性被发现的。1892年俄国植物病理学家D.Ivanovsky研究了烟草花叶病的病原,认为它是一种能通过细菌滤器的“细菌毒素”或极小的“细菌”。1898年荷兰学者M.W.B eijerinck独立进行了烟草花叶病病原体的研究,首次提出其病原是一种“传染性的活性液体 ”或称“病毒”。1935年美国的Stanley首次提纯并结晶了烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV),从而使人们对病毒化学本质的认识有了重大突破,并为病毒的深入研究开辟了广阔的领域。自1971年起人们陆续发现了各种亚病毒——类病毒、拟病毒和朊病毒。至今,病毒作为遗传工程中外源基因载体的研究正在扩大和深入。大多数已知病毒都是致病因子,但并非所有病毒都对宿主有害。例如存在于人和兽类呼吸道和肠道中的呼肠孤病毒(Reovirus) 。在历史上,一度引人喜爱的“杂色郁金香”,实际上是郁金香受病毒感染后病叶出现杂色条纹和斑驳。
----对非细胞生物,我们把它分成病毒(即真病毒,Euvirus)和亚病毒加以讨论。
欠缺!
----对病毒下一个完整、确切及能被普遍接受的定义还不容易。现将病毒区别于其他生物的主要特征归纳如下:①无细胞结构。仅含有一种类型的核酸——DNA或RNA,至今尚未发现二者兼有的病毒;②大部分病毒没有酶或酶系统极不完全,不含催化能量和物质代谢的酶,不能进行独立的代谢作用;③严格的活细胞内寄生,没有自身的核糖体,不能生长也不进行二均分裂,必须 依赖宿主细胞进行自身的核酸复制,形成子代;④个体极小,能通过细菌滤器,在电子显微镜下才可看见;⑤对抗生素及磺胺药物不敏感,对干扰素敏感。
----据以上特点,可以认为:病毒是超显微的非细胞生物。每一种病毒只含有一种核酸;它们只能在活细胞内营专性寄生,靠其宿主代谢系统的协助复制核酸、合成蛋白质等组分,然后再进行装配而得以增殖;在离体条件下,它们能以无生命的化学大分子状态长期存在并保持其侵染活性。
一、病毒的形态
----尽管来源于不同宿主的病毒种类很多,但是病毒的形状大体归为以下3类。
----1.球形颗粒
----这类病毒颗粒形状呈球形,严格地说是接近球形,所以这类颗粒也常称做拟球形颗粒。其中, 那些外表面无包膜的病毒颗粒常称做等轴颗粒。砖形颗粒(如痘病毒)和椭圆形颗粒(如传染 性脓疱病毒)均属于球形颗粒的变形。
----2.杆状颗粒
----这类病毒颗粒形状呈长杆状。有的为刚直杆状,如烟草花叶病毒;有的为弯曲杆状,如马铃薯X 病毒(Potato virus X, PVX);有的极其细长且非常柔韧呈丝形,如甜菜黄化病毒(Beet yello w virus, BYV)
----3.复合状病毒
----大多数噬菌体特有,是球形颗粒和杆状颗粒的结合体,病毒体如蝌蚪状。有的病毒,如感染植 物的多分体病毒,系由几个大小和形状不同的颗粒所组成的复合体。
------------ ------ 
二 、病毒的大小
----1.大小范围
----病毒没有生长过程,故装配成熟的病毒体大小恒定不变。在描述病毒的线性长度时,单位常用纳米(nm)。不同病毒大小差异甚大。大多数界于10～300nm(表4—1)。最大的病毒是痘病毒, 其大小为300×250×100nm;最小的病毒为烟草坏死病毒的卫星病毒或双生病毒,其大小为15n m或18nm;最长的病毒为鞭毛绸绿色杆菌噬菌体或甜菜黄化病毒,其大小为10×1300nm。大病毒等于或大于小细菌,小病毒等于或小于大的蛋白质分子。由于测定条件和方法不同,同一种病毒其大小在不同的文献中略有出入,但变动范围不大。
----2.测量大小的方法
----超滤法--根据病毒粒子能通过哪种孔径的超滤膜(50nm;100nm;200nm3种滤膜 孔径)以估计其大小。
----电镜法 -样品负染,在电子显微镜下投影确定形态,照像后用尺子测量,据放 大倍数推算其大小。
----超速离心沉降法--据病毒粒子在悬浮液中的沉降速度 ,间接测定病毒大小和分子量。因为沉降速度取决于病毒的大小、质量和介质的粘度等。
----电泳法--根据电泳速度测定病毒粒子大小。一般来说,颗粒带静电荷量越多, 颗粒越小,越近球形,则电泳速度越快。
三、病毒的化学组成
----病毒的化学组成因种而异,分析表明,病毒的基本化学组成是核酸和蛋白质。有包膜的病毒和某些无包膜的病毒除核酸和蛋白质外,还含有脂类和多糖(常以糖脂、糖蛋白方式存在)。有 的病毒还含有聚胺类化合物及无机阳离子等组份。
表4—1 病毒的大小
|
类 别 |
病 毒 |
长×宽或直径(nm) |
|
动物病毒
|
痘病毒(Poxvirus)
家蚕细胞核形多角体病毒(Banbyx mori nuclcar polyhcdrosis virus)
疱疹病毒(Herpcsvirus)
大蚊虹色病毒(Tipula iridcsccnt virus)
新城疫病毒(Ncwcastlc disease virus)
腺病毒(Adenovirus)
流感病毒(Lnflucnza virus)
鸡瘟病毒(Fowl plaguc virus)
家蚕细胞质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhcdrosis virus)
多瘤病毒(Polyomavirus)
脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)
口蹄疫病毒(Foot-and-mouth discase virus) |
200～350×200～250
50～400×40～ 70
100～150
130
115
70～90
80～85
70～80
60
43
27～30
22
|
|
植物病毒
|
马铃薯Y病毒(Potato virus Y)
马铃薯X病毒(Potato virus X)
烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus)
黄瓜绿斑花叶病毒(Cucumber grccn mottlc mosaic rirus)
萝卜花叶病毒(Radish mosaic virus)
苜宿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus)
马铃薯黄矮病毒(Potato yellow dwarf virus)
番茄丛矮病毒(Tomato bushy stuntvirus)
芜菁黄叶病毒(Turnip ycllow mosaic virus)
烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus)
南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus) |
750×12
520×10
300×15
280×16
120×25
58×18
110
30
26
26
22 |
|
噬菌体
|
大肠杆菌噬菌体T2、T4、T6(Coliphagc T2、T4、T6)
大肠杆菌噬菌体T1(Coliphage T1)
大肠杆菌噬菌体T3(Coliphage T3)
大肠杆菌噬菌体T5(Coliphage T5)
大肠杆菌噬菌体T7(Coliphage T7)
大肠杆菌噬菌体fd(Coliphage fd)
大肠杆菌噬菌体f2(Coliphage f2)
痢疾杆菌噬菌体
灰色放线菌噬菌体
分枝杆菌噬菌体
大肠杆菌噬菌体ΦX174(Coliphagc ΦX174)
大肠杆菌噬菌体M13(Coliphagc M13) |
头部90×60 尾部100×20
40 160×10
45 10×10
65 170×10
45 10×10
700×5
25
头部65～70 尾部150×～
50 150×15
80～90×35 160～190×20
直径20～30
长600～800 |
----1.核酸
----核酸是病毒的遗传物质,是病毒感染宿主的物质基础。在原核生物(包括细菌、蓝藻、支原体 、螺旋体等)病毒中,除在细菌病毒中发现有少数病毒含RNA外,其余都含DNA。侵染植物和真菌的大多数病毒都是RNA病毒。在动物病毒(包括脊椎动物病毒和无脊椎动物病毒)中,DNA病毒和RNA病毒兼而有之。除逆转录病毒(Retroviruses)的RNA基因组是二倍体外,其它所有的 病毒基因组都是单倍体,它们仅含有每个基因的一个拷贝。现将各种代表性病毒的核酸类型列在表4—2中。
表4—2 若干代表性病毒的核酸类型
|
核酸类型 |
病毒种类 |
|
动物病毒 |
植物病毒 |
微生物病毒 |
|
DNA |
ss
DNA
|
线
状 |
细小DNA病毒(如鼠细小病毒,腺联病毒,大蜡螟浓核症病毒) |
双生病毒(如玉米 条纹病毒,木薯潜隐病毒,菜豆夏枯病毒) |
|
|
环
状 |
|
|
E.coli的ΦX174、M13、fd和fl噬菌体等 |
|
ds
DNA |
线
状 |
各种腺病毒、疱疹病毒、虹彩病毒和痘病毒 |
|
E.coli的T系、P1、P2和Mu,枯草杆菌的PBSX、SP01,沙门氏菌的P22噬菌体等 |
|
环
状 |
乳多孔病毒(如猴、SV40病毒,鼠多瘤病毒等) |
花椰菜花叶病 毒组(如大丽菊花叶病毒,香石竹蚀环病毒等12种) |
E.coli的λ、铜绿假单胞菌的PM2噬菌体等 |
|
RNA |
ssRNA
（线状） |
细小RNA病毒(如脊髓灰质炎病毒,牛口蹄疫病毒),披盖病毒(黄热病毒,登革热病毒),弹状病毒(如狂犬病毒,水疱性口膜炎病毒),副粘病毒(如麻疹病毒,腮腺炎病毒,新城疫病毒),正粘病毒(如流感病毒),逆转病毒(如劳氏肉瘤病毒等) |
烟草花叶病毒,烟草脆裂病毒,马铃薯X(Y、S)病毒;雀麦花叶病毒,豇豆斑驳病毒,黄瓜花叶病毒,大麦黄化病毒,烟草环斑病毒,番茄丛矮病毒,芜菁黄花叶病毒;马铃薯黄矮病毒;苜蓿花叶病毒;甜菜黄花病毒;球叶莴苣坏死黄化病毒 |
各种RNA噬菌体(如E.coli的MS2、Qβ、f2、R17) |
|
dsRNA
(线状) |
呼肠孤病毒,质型多角体病毒 |
伤瘤病毒(如玉米矮缩病毒,水稻矮化病毒) |
各种真菌病毒,假单胞菌的Φ6噬菌体 |
----由上表可知,病毒的核酸类型极其多样。总的说来,动物病毒以线状的dsDNA和ssRNA为多,[dsDNA、ssDNA中ds表示双链(double strand),ss表示单链(single strand)]植物病毒以ssRNA为主,噬菌体以线状的dsDNA居多,而至今发现的真菌病毒都是dsRNA,藻类病毒则都是dsDNA。
----病毒的核酸含量指核酸的分子量占病毒颗粒重量的百分比。高者如T-偶数噬菌体(T-even phage)的DNA几乎占病毒颗粒重量的50%,低者如TMV,其RNA的含量只有5%。流感病毒RNA的含量还不到1%。不同病毒的核酸其分子量也有很大的差异。病毒DNA的分子量为(1.5～250)×10~6，病毒RNA的分子量为(0.4～20)×10~6。
病毒核酸的功能与细胞型生物一样,是遗传的物质基础,携带着遗传信息,指导病毒蛋白质的 合成,控制着病毒的遗传、变异、增殖以及对宿主的感染性。病毒核酸对衣壳的形成与稳定也有一定的作用。
----2.蛋白质
----蛋白质是病毒的另一类极其重要的化学组成。其氨基酸组成同其它生物一样,没有任何特殊之处。病毒蛋白质可据其是否存在于病毒体中而分为两类:结构蛋白(structural protein)和非结构蛋白(non-structural protein)。前者系指构成一个完整的、形态成熟的病毒颗粒所必需的蛋白质。包括壳体蛋白、包膜蛋白和存在于病毒体中的酶等。后者系指由病毒基因组所编码的,但并不结合于病毒颗粒中的蛋白质,如复制酶和装配酶等。
----病毒蛋白质的功能是构成病毒壳体,使病毒有一定大小形态,维持病毒结构。壳体具保护作用 ,使核酸免受酶或其它理化因子的影响。另外,它还参与病毒感染过程,决定宿主范围,表现为 吸附作用。如T2噬菌体靠尾丝吸附于宿主的接受位点上。蛋白质也决定病毒的抗原性。蛋白质为良好的抗原,病毒表面有蛋白质,故病毒亦为良好抗原。将蛋白质注入体内——此即预 防病毒感染的原理。蛋白质是发生毒性反应的主要成分,对机体或细胞有毒性作用。此外,病毒蛋白质还构成了病毒组成中的酶。其中一类是分解性酶,能破坏宿主细胞膜和细胞壁,如噬菌体溶菌酶、流感病毒的神经氨酸酶等;另一类是合成性酶,主要催化核酸的合成,如呼肠孤病毒的RNA转录酶,鸡新城疫病毒的RNA聚合酶以及Rous肉瘤病毒的以RNA为指导的DNA聚合酶(或称逆转录酶)等,它们在复制中起作用。但是一般来说,病毒是不具酶或酶系极不完全的,所以一旦离开宿主就不能进行独立的代谢和繁殖。
----3.脂质
----许多病毒体内存在有脂类化合物,其脂质成分有磷脂、脂肪酸、甘油三酸脂和胆固醇等,但主要以磷脂形式存在。不同的病毒其脂类含量差异很大。如马脑炎病毒的脂质含量高达54%,痘苗病毒的脂质含量仅为5%。
----脂质主要存在于病毒的包膜内,它们构成脂双层而成为病毒包膜的骨架。包膜的脂质成分均来源于宿主细胞膜或核膜。所以包膜内的脂质含量与种类都与宿主细胞膜相同,即具有宿主特异性。
----4.碳水化合物
----除病毒核酸中所含的戊糖外,有些病毒还含有少量的碳水化合物,其中绝大多数是有包膜的病毒。在有包膜的病毒中,碳水化合物以寡糖侧链的形式与蛋白质结合形成包膜糖蛋白,也有碳水化合物与包膜中的脂质结合成糖脂的情况存在。在无包膜的病毒中有少数病毒也含有碳水化合物,且均以糖蛋白的形式存在。如腺病毒壳体上的五邻体纤维即是一种糖蛋白。五邻体纤维具有血细胞凝集活性,是病毒的吸附蛋白。
----碳水化合物的功能为抵抗核酸酶降解。因为核酸酶只破坏未经修饰的DNA。如在T-偶数噬菌体基因组DNA的5-羟甲基胞嘧啶上,以氧-葡萄糖苷键结合有葡萄糖。5-羟甲基胞嘧啶的葡萄 糖基化可以保护噬菌体DNA免遭核酸酶破坏。即葡萄糖基化是T-偶数噬菌体生存必须的。糖类物质位于病毒粒子表面,影响病毒的吸附侵入,与病毒感染有关。糖类物质还参与凝集反应 。一些病毒具血凝素，以糖苷酶处理流感病毒，病毒血凝素糖蛋白的寡糖链部分降解，病毒血凝活性随之丧失，说明碳水化合物对病毒血凝活性有重要作用。
----5.其它成分
----在某些动物病毒、植物病毒和噬菌体体内，存在有多胺类有机阳离子化合物，包括丁二胺、 亚精胺、精胺等。在某些植物病毒中还发现有14种金属阳离子存在。如在烟草花叶病毒中发现有Fe、Ca、Mg、Cu、Al等金属离子。这些含量极微的有机阳离子和无机阳离子与病毒核酸呈无规则的结合。由于病毒体中所含阳离子的性质和数量没有特异性，结合量仅与环境中相关离子的浓度和亲合性有关，所以它们是病毒在装配成熟时偶然从环境中获得的不恒定成分。在某些病毒体内，还发现有其它的小分子组分。如在有尾噬菌体尾部结合有一定数量的ATP。TP在噬菌体感染过程中可能为尾鞘的收缩提供所需的能量。
四、病毒的结构
----电子显微镜技术与生物化学、X射线衍射等分析技术的结合,揭示了病毒粒子亚显微结构的各 种特征,已经有可能观察分析病毒粒子的空间细微结构。典型的病毒体的基本结构:一个核酸 分子结合在一个由许多相同的蛋白质分子形成的鞘(Shell)内。结构较复杂的病毒体可能含有多个核酸分子,有数种或更多种不同的蛋白质。
----病毒是非细胞生物,故单个病毒个体不能称作“单细胞”,一般称为病毒粒子(virion,即病毒体)。病毒粒子有时也称病毒颗粒(virus particle),是指成熟的、结构完整有侵染力的单个病毒。在病毒的结构组成中,包围着病毒核酸及其结合蛋白的蛋白质鞘称做壳体(capsid),或外壳。在病毒的二十面体(icosahedron)壳体构成中, 一定数目的蛋白质亚基以特殊方式聚集，形成在电镜下可见的壳粒(capsomer)。壳粒通常由5～6个蛋白质亚基聚集形成,因而将它们分别称做五聚体(pentamers)或六聚体(hexmers),当然也可由两个或3个蛋白质亚基聚集 而成。由病毒核酸及其结合蛋白组成,并被壳体包围着的病毒体的中心部分称作核心(core), 壳体与核心一起构成的复合结构为核壳体(nucleocapsid)。一些简单的病毒如烟草花叶病毒 ,脊髓灰质炎病毒等的病毒体就是一个核壳结构。而一些复杂病毒的核壳外还有一层膜结构, 甚至更为复杂,覆盖在核壳外的脂蛋白膜称做包膜(envelope)。包膜是病毒成熟时由细胞膜衍生而来的,但被病毒改造成具有其独特抗原特性的膜状结构,故易被乙醚等脂溶剂破坏。许多病毒的表面有一些排列规则和外凸出的突起,呈放射状称为刺突(spikes)。刺突多见于有 包膜病毒的包膜表面,其性质是糖蛋白。这种病毒包膜表面的糖蛋白突起也称做包膜突起(peplomer)或突出体。图4—1为病毒粒子的切面(上)和病毒粒子的模式构造(下)。
----由于衣壳粒排列组合的方式不同,病毒粒子往往表现出不同的构型和形状。
图 4-1 病毒粒子的切面(上)
A.一枚无套膜病毒粒子的切面。螺旋式对称；B.一个有套膜病毒粒子的切面
图4—1 病毒粒子的模式构造(下)
(1)二十面体对称病毒；(2)螺旋对称病毒
----1.螺旋对称结构(helical symmetry)
----这种结构给病毒壳体以杆状或丝状外观。蛋白质亚基有规律地沿着中心轴呈螺旋排列,进而形成高度有序、对称的稳定结构。核酸位于壳体内侧的螺旋状沟中,多为单链RNA。该结构以烟草花叶病毒了解得最为清楚,其形态构造见图4—2。
----2.二十面体对称结构(icosahedralsymmetry)
----这种结构给病毒壳体以近球形外观。高分辨率电镜观察及其X射线衍射图分析表明,该种病毒壳体均为二十面体对称结构。蛋白质亚基围绕具立体对称的正二十面体的角或边排列,进而形成1个封闭的蛋白质鞘。廿面体是具有20个三角形面,30条边和12个顶的多面体。1个正廿面体的三角形面均为等边三角形,并且有5次、3次和2次对称轴。在廿面体的顶上,5个亚基聚集形成电镜下可见的五聚体。由于它与5个其它壳粒相邻,通常又叫做五邻体(penton)。廿面 体所有的12个五邻体顶仍保留,但另有六聚体在基本三角面上形成,由于每个六聚体分别与6个壳粒相邻,故常称作六邻体(hexon)。如,卫星烟草坏死病毒具12个五邻体;腺病毒Ⅴ型具12个五邻体,240个六邻体;芜菁黄化花叶病毒具12个五邻体,20个六邻体。
图4—2 烟草花叶病毒的形态构造
图4—3 二十面体结构
A.二重对称轴；B.三重对称轴；C.五重对称轴；
D .3个壳粒排列成20枚3联体；E.12枚5联体和20枚6联体；F.数目庞大的壳粒
----在廿面体壳体中,病毒核酸盘绕折叠在壳体的有限空间里。具有二十面体壳体的病毒多无包膜。无论是在裸露的或有包膜的廿面体病毒的制备物中,都发现有空壳体(empty capsid)存在 ,壳体内没有核酸。这表明核酸的存在对于廿面体壳体的形成并非必需。然而,空壳体较之完整的病毒颗粒更容易降解,所以核酸的结合无疑有助于增加廿面体壳体的稳定性。廿面体病毒粒子结构见图4—3。该结构的代表是腺病毒。腺病毒的外形呈典型的二十面体,粗看像“ 球状”,没有包膜,直径为70～80nm。它有12个角、20个面和30个棱。衣壳由252个衣壳粒组成,内有称作五邻体的衣壳粒12个(分子量各为70，000Da),分布在12个顶角上,还有称作六邻体的衣壳粒240个(分子量各为120，000Da),均匀分布在20个面上。每个五邻体上突出一根末 端带有顶球的蛋白纤维,称为刺突。腺病毒的核心是由线状双链DNA(dsDNA)构成的。所有的腺病毒,不管它们的天然宿主和血清型是什么,其基因组的大小都约为36，500个核苷酸对。
----3.复合对称壳体(complex symmetry)
----以上分别叙述了病毒壳体的两种主要结构类型,但也有少数病毒的壳体为复合对称结构。壳体既有螺旋对称结构, 又有廿面体对称部分。具有复合对称壳体结构的典型例子是有尾噬菌体。这类噬菌体都无包膜,壳体由头部和尾部组成。头部通常呈二十面体对称,尾部呈螺旋对称。如T-偶数噬菌体的头部长约110nm,直径约60nm,为一变形的廿面体结构。头部含有结合着多胺、几种内部蛋白和小肽的双链DNA。其尾部结构复杂,由尾管(tail tube)、尾鞘(tail sheath)、颈部(collar)、基片(base plate)、尾钉(tail pin)和尾丝(tail fiber)5个主要部分组成。(T4的模式结构见图4—4)。
图4—4 大肠杆菌T4噬菌体的模式图
a.游离的噬菌体；b.噬菌体的尾鞘收缩和尾管穿入细菌细胞
----尾鞘--长约95nm,由两种结构蛋白构成,系由144个壳粒构成螺旋对称结构,每转螺旋含6个壳粒。尾鞘伸展时螺旋转数为24,收缩时尾鞘变得短而粗,螺旋转数减至12。
----尾管--尾管在尾鞘内部,长80～100nm,由两种结构蛋白组成。尾管中空,感染时,病毒DNA由头部通过尾管进入细胞。与尾鞘一样,也是有24个螺转的螺旋结构。
----基片--基片连接在尾部末端,为六角形、结构复杂的盘状物。在基片的6个角上,各结合有一短的尾钉和长的尾丝。
----尾丝--共有6根,直径约2nm,长约65nm。由等长的两部分组成。尾丝是噬菌体吸附于宿主细胞的器官。
----颈部--颈部呈薄盘状,与基片相似,平均直径约37.5nm。其功能为连接头部和尾部。
第二节 病毒的种类与分类
自从伊万诺夫斯基发现病毒以来,迄今已有一百多年的历史。随着科学技术的不断发展,研究工作日趋广泛深入,新的病毒数量陆续增加。据统计,动物病毒已由1970年的500多种增至600种以上,其中对人致病的也相当多。病毒分布极为广泛,几乎可以感染所有的生物,包括各类微生物、植物、昆虫、鱼类、禽类、哺乳动物和人类。机体携带病毒并非必然引起疾病,现已分离到不少病毒对其宿主无致病作用。
----病毒种类虽多,但它们具有共同特征,相互间有一定的内在联系。病毒分类就是要将已发现的病毒归纳成有秩序的分类系统。几十年来,很多病毒学家为了寻找一个既能比较科学地反映病毒内在联系,又能被大家所接受的分类方法,作了不懈的努力,探索了很多途径,提出了大量的方案,目前仍不很成熟。随着某些新技术,特别是电子显微技术和生化技术的发展应用,病毒分类将一定会趋于完善。
一、病毒的类型
----由于病毒的专性寄生性,在病毒的早期分类中,很自然地侧重于按宿主范围,或以其侵入的特异性器官和组织部位,或据病毒的传播方式及致病性分类命名。这种分类显然不科学,人为因素较多。为实际应用和叙述的方便,此处仅根据宿主的不同将病毒分为动物病毒、植物病毒和微生物病毒。动物病毒又可分为脊椎动物病毒和无脊椎动物病毒,无脊椎动物病毒中尤以昆虫病毒最为重要。
----1.动物病毒
----脊椎动物病毒--寄生于脊椎动物细胞内,是人和其他动物多种传染病的病原。有砖形、球形或卵圆形。核酸为RNA或DNA。
----该病毒的危害程度远远超过其他微生物引起的传染病。据估计,人类的传染病80%由病毒引起 。诸如流行性感冒、肝炎、麻疹、水痘、腮腺炎、流行性乙型脑炎、脊髓灰质炎及爱滋病等人类的常见病都是由病毒引起的。这些病毒性疾病,传染性强,流行范围广,死亡率较高。在人类的恶性肿瘤中,约有15%是由于病毒感染诱发的。家畜和其它哺乳动物中的病毒病也极为普遍,如猪瘟、牛瘟、口蹄疫、马传染性病毒病和兔的乳头状瘤等。家禽中则有鸡新城疫、鸡瘟和鸡的劳斯氏肉瘤等。病毒如何引起肿瘤,迄今仍不清楚。但病毒的致肿瘤效应,可通过多种方法确定。如可以借接种实验动物能否形成肿瘤,或者借组织培养法,接种病毒后正常细 胞是否转化为肿瘤细胞证明病毒的致癌性。正常与肿瘤细胞可以通过细胞的聚积反应来区别 。肿瘤细胞失去了细胞接触抑制作用,迅速生长,聚积成团;正常细胞呈单层生长。在研究肿瘤细胞转化过程中还发现,在感染了病毒的转化细胞中找不到完整的病毒粒子,但有病毒DNA 存在,并整合到宿主细胞的DNA上,以原病毒的形式存在,类似于溶原性细菌的原噬菌体。病毒引起肿瘤似乎在于将其遗传物质引进了宿主细胞。所有致肿瘤病毒可分为含DNA及RNA的两大类。含RNA的致肿瘤病毒属逆转录病毒,均含逆转录酶,它们的基因组皆为单链RNA分子,病毒的形态结构也相似。
----无脊椎动物病毒--无脊椎动物病毒主要在节肢动物的昆虫纲中发现,亦见于螨蛛纲与甲壳纲动物。这里仅以昆虫病毒为例予以介绍。
----昆虫病毒寄生于无脊椎动物昆虫的细胞内,呈杆状或球状,核酸为RNA或DNA。最大特点是病毒粒子在寄主细胞内常包埋于蛋白质基质中形成包涵体(inclusions),又称内含体。据包涵体 的有无及包涵体在细胞中的位置及形状,可将昆虫病毒分为4类:
----核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus,NPV)--病毒粒子杆状,是双股DNA病毒。该病毒包在包涵体内,包涵体呈多面体,位于宿主细胞核内。这类病毒已从鳞翅目、膜翅目与双翅目,并偶尔从脉翅目昆虫中分离得到。感染家蚕、柞蚕和蓖麻蚕的病毒,有的也属于细胞核型多角体病毒,它们引起蚕病,对养蚕业危害很大。
----核型多角体病毒主要通过口器传染。被核型多角体感染致死的幼虫是感染源,释放出大量多 角体。被活虫吞食,包涵体在虫体内被消化,释放出病毒粒子,侵入细胞核,在核内繁殖并形成 角体,杀死寄主后,成为新的感染源。
----昆虫幼虫感染核型多角体病毒后,食欲减退,动作迟钝,随后躯体软化,体内组织液化,白色或 褐色体液从破裂的皮肤流出,一般从感染到死亡整个过程为4～20天。病死的幼虫倒吊在植物枝条上,由于组织液化下坠,使下端膨大,这是感染虫体的特征。
----质型多角体病毒(cytoplasmic polyhedrosis virus,CPV)--病毒粒子近球形,直径约60nm,是多面体双链RNA病毒。一个多角体包涵体内含有多个病毒粒子。多角体被幼虫吞食后,在中肠被消化。病毒粒子侵入中肠、前肠和后肠细胞,在细胞质内增殖,并形成多角体,不能侵入其它组织。感染的幼虫食欲不振,上吐下泄,排出大量多角体。 中肠肿大,呈乳白色,血淋巴及皮肤不破坏,死虫躯体萎缩,无倒挂特征。
----颗粒体病毒(granulosis virus, GV)--包涵体呈圆形及椭圆形颗粒状。病毒颗粒杆状,含双链DNA。包涵体内只含一个病毒颗粒,偶尔含有两个。主要感染鳞翅目昆虫的真皮、脂肪组织及血细胞等。昆虫吞食后停止进食,在肠道中将包涵体消化掉,释放出病毒粒子,侵入真皮、脂肪组织及气管和中肠皮层,先进入细胞核,在核内繁殖,随后释放到细胞质内,形成只含有一个病毒粒子的包涵体(颗粒体)。死虫特征与核多角体病毒感染相似。我国已制成菜粉蝶颗粒体病毒制剂用于生物防治。
----无包涵体病毒--病毒粒子球形,不形成包涵体。宿主范围广泛,除昆虫纲外,还存在于蜘蛛纲、甲壳纲等。
----用昆虫病毒防治农林害虫具有专一性高,扩散性强,毒力较大,后效较久,使用方便,对人畜较安全等优点。且能保护自然环境,防除化学农药公害。因此,它是一种有着广阔前景的病毒农 药,已成为害虫综合防治中的重要一环,是生物防治中的一个活跃的领域。
---- -----
-- ---
----2.植物病毒
----植物病毒大多是含单链RNA的病毒。按粒子形态分为3种类型:杆状、线状或近球形的多面体。有些植物病毒也具有囊膜。
----植物病毒和其它病毒一样是严格寄生生物,但它们的专化性不强。一种病毒往往能寄生在不同的科、属、种的栽培植物和野生植物上。例如烟草花叶病毒能侵染十几个科、百余种草本 和木本植物。植物感染病毒后可使植物表现出3类症状:①叶绿体受到破坏或不能形成叶绿素 ,从而引起花叶、黄化、红化等症状;②植株矮化、丛簇、畸形等;③形成枯斑及坏死等。病毒侵染植物除造成上述外表症状外,还有内部细胞的或组织的不正常表现。最突出的表现是在感染病毒植株的细胞内形成细胞包涵体,这在花叶病毒病中发生较普遍。细胞包涵体分为两类，一类是结晶形的,另一类是非结晶形的(又称为X-小体)。结晶形包涵体通常由病毒粒子堆叠而成;在非结晶形的包涵体中,有不少是病毒粒子和寄主细胞成分混合而成。结晶形的包涵体无色透明,呈六角形、长条形或不规则状晶体。有的呈纺锤状、针状或卷曲成8字形的长纤维状。非结晶形包涵体多半是半透明的颗粒状聚积体,呈圆形或椭圆形。包涵体在细胞内的分布因病毒而异,在原生质体、细胞核及叶绿体,甚至在空胞内都可以见到有包涵体存在。
----植物病毒的传播感染途径有:①昆虫传播是自然条件下最主要的传播途径。主要的虫媒是半 翅目刺吸式口器的昆虫,蚜虫、叶蝉和飞虱；②病株的汁液接触无病植株伤口,可以使健康植株感染病毒。病毒一般很少从植物的自然孔口侵入；③嫁接传染。几乎所有全株性的病毒病都能通过嫁接传染。
----3.微生物病毒
----侵染细菌、放线菌等细胞型微生物的病毒叫噬菌体(在第四节中系统介绍)。
---- ----------
二、病毒的分类
----病毒分类大致经历了3个阶段:最早根据病毒与宿主的相互关系来分;随着近代电子显微镜技术的发展以及分离、提纯病毒新方法的应用,逐渐转向对病毒本身的结构特征、化学组成进行较详细的研究,使病毒的分类逐渐摆脱人为因素,朝着自然分类系统的方向前进;现在以病毒生化特性为依据,特别强调病毒核酸的结构,因此更能反映病毒的本质。国际病毒分类委员会(ICTV)通过的关于病毒分类的第4次报告(1982年)提出了更适用于所有病毒的分类和命名原则。病毒分类遵照以下原则:①核酸的类型、结构和分子量;②病毒体的形状和大小;③病毒体的形态学结构;④病毒体对乙醚、氯仿等脂溶剂的敏感性;⑤血清学性质和抗原关系;⑥ 病毒在细胞培养上的繁殖特征;⑦对脂溶剂以外其它物化因子的敏感性;⑧流行病学特征。它是第4个病毒分类方案,也是目前最新的病毒分类系统。据此,将现知病毒分为7大类,共59科。
第三节 病毒的增殖
病毒的增殖方式与细胞型微生物不同。病毒是专性活细胞内寄生物,缺乏生活细胞所具备的细胞器(如核糖体、线粒体等)以及代谢必需的酶系统和能量。增殖所需的原料、能量和生物合成的场所均由宿主细胞提供,在病毒核酸的控制下合成病毒的核酸(DNA或RNA)与蛋白质等成分,然后在宿主细胞的细胞质或细胞核内装配为成熟的、具感染性的病毒粒子,再以各种方式释放至细胞外,感染其它细胞。这种增殖方式称为复制(replication)。整个过程称为复制周期(replicative cycle)。无论是动物病毒、植物病毒或细菌病毒,其繁殖过程虽不完全相同,但基本相似。概括起来可 分为吸附、侵入与脱壳、复制、装配以及释放5个连续步骤。每一步骤的结果和时间长短都随病毒种类、病毒的核酸类型、培养温度及宿主细胞种类不同而异。如果其中某一阶段发生缺损,就可导致复制过程不正常,形成顿挫感染和缺损病毒。
----1.吸附(adsoprption)
----吸附是病毒感染宿主细胞的第一步,具有高度的专一性。病毒粒子由于随机碰撞或布朗运动, 通过静电引力而与敏感细胞表面接触。这种吸附作用往往是暂时的。在通常情况下,敏感细胞表面具有特异性表面化学组分作为接受部位,病毒也含有与其“互补”的特异性化学组分作为吸附部位,这种吸附作用才是不可逆的。
--------- -------
-- ---
----2.侵入(penetration)与脱壳(encoating)
----病毒侵入的方式取决于宿主细胞的性质,尤其是它的表面结构。病毒对具有细胞壁的和不具有细胞壁细胞的侵入方式不一样。就动物病毒来说,侵入敏感细胞至少有4种方式:① 借吞噬或吞饮作用将整个病毒粒子包入敏感细胞内。这是一个主动过程,如痘类病毒;②具脂蛋白囊膜的病毒(如流感病毒),其囊膜首先与宿主细胞膜融合或相互作用使之脱去囊膜,核衣壳直接侵入细胞质中; ③某些病毒粒子与宿主细胞膜上的受体相互作用,从而使核衣壳侵入细胞质中,如脊髓灰质炎病毒;④有的病毒能以完整的病毒粒子直接通过宿主细胞膜穿入细胞质中,如呼肠孤病毒。植物病毒没有专门的侵入机制,因植物细胞具有坚韧的细胞壁,故一般通过表面伤口或刺吸式昆虫口器插入到植物细胞中去。植物病毒一旦进入细胞,病毒粒子或其核酸也可通过胞间连丝由一个细胞蔓延到相邻的另一个细胞;如果病毒进入植物的输导组织, 它们就迅速地向其他部位扩散,引起普遍感染。脱壳(encoating)即病毒粒子脱去衣壳和囊膜。这是病毒核酸和蛋白质复制的必要前提,其方式因种而异。有些无囊膜的病毒,在吸附和侵入细胞时,衣壳已开始破损,核酸便释放入细胞 质中;某些有囊膜的病毒,在敏感细胞膜表面除去囊膜,再以完整的核衣壳侵入细胞质中;以吞饮方式进入宿主细胞的病毒,则在吞噬泡中与溶酶体融合,经溶酶体的作用而脱壳;腺病毒,因宿主细胞酶的作用或经某种物理因素而脱壳;痘苗病毒等复合病毒,通过吞噬作用进入细胞后 ,脱去衣壳要经两步:首先在吞噬泡中脱去囊膜和部分蛋白质,经过部分脱壳的核衣壳, 含有一种以DNA为模板的RNA聚合酶,转录mRNA,以翻译另一种脱壳酶,完成这种病毒的全脱壳过程。
----3.复制(replication)
----包括病毒核酸的复制和蛋白质的合成。病毒侵入敏感细胞后,将核酸释放于细胞中,此时,该病毒粒子已不存在,并失去了原有的感染性,开始了自己的核 酸复制与蛋白质合成。与此同时,宿主细胞的代谢也发生了改变：宿主细胞内的生物合成不 再由细胞本身支配,而受病毒核酸携带的遗传信息控制。病毒利用宿主细胞的合成机构,如核 糖体、tRNA,以及酶与ATP等,使病毒核酸复制,并合成大量病毒蛋白质。虽然宿主细胞能为病 毒提供大部分合成条件,但毕竟不是全部,而且某些新的酶要用病毒提供的遗传信息合成。这 些病毒的特异性酶蛋白和蛋白质外壳的合成,是利用病毒感染后合成的mRNA实现的。因此,病 毒复制的第一步是病毒mRNA的合成。
图4—5 五类不同核酸型的病毒在感染宿主后的六种mRNA合成方式
①T偶数噬菌体，痘病毒，花椰菜花叶病毒，多瘤病毒等；②ΦX174，细小病毒；③呼肠孤病毒，水稻矮缩病毒；④TMV，脊髓灰质炎病毒，f2噬菌体；⑤水泡性口膜炎病毒；⑥逆转病毒(劳氏肉瘤病毒等各种肿瘤病毒)。图中假mRNA的互补性为“+”的；“+”或“-”表示与mRNA相同的或互补的单链；“±”表示一条互补双链
图4—6 有囊膜病毒以“出 芽”方式释放示意图
----亲代病毒的生物学特性遗传给子代病毒的关键,是如何把不同类型核酸中的遗传信息转移到病毒的mRNA中。就目前所知,病毒复制共有6种方式(图4 —5)。
----双链DNA复制--病毒DNA的复制、转录和翻译均按“中心法则”进行。DNA既可作复制的模板,通过半保留方式复制出子代病毒的DNA,又可翻译为成熟病毒所需的衣壳蛋白。
----单链DNA复制--所有ssDNA病毒的核酸均为+DNA。先由+DNA合成±DNA,然后以 新合成的-DNA为模板合成+mRNA。
----双链RNA复制--首先通过半保留方式复制,利用其中的“-”链产生“+”RNA, 即mRNA,它可翻译出蛋白质,又可作为模板复制出子代双链RNA。
----侵染性单链RNA复制--侵染性ssRNA指由病毒粒子中分离出来有侵染性的RNA 。这种侵染性RNA既可作为mRNA以翻译成蛋白质,又可作为模板复制成-RNA,然后再利用此-RNA作模板来合成子代+RNA。
----非侵染性单链RNA复制--这类病毒的单链RNA没有侵染性,也不能起信使作用, 所以叫负链RNA(-RNA)。当病毒粒子携带转录酶时,-RNA可用作转录+RNA(即mRNA)的模板,并由它翻译出几种蛋白质,其中包括1种RNA复制酶。在这种RNA复制酶的催化下合成与负链等长的+RNA,再以此作模板合成子代病毒的-RNA。
----逆转录病毒单链RNA复制--逆转录病毒单链RNA在其复制过程中会形成RNA—DNA杂交分子和双链DNA两种中间体。RNA-DNA杂交分子是在病毒粒子中所含的1种反转录酶——依赖于RNA的DNA聚合酶的催化下合成的。所合成的DNA链在1种依赖于DNA的DNA聚合酶的作用下再合成双链DNA。此双链DNA(±DNA)具有侵染性,并可整合到宿主细胞的DNA分子上,以它为模板合成子代单链RNA。其子代RNA和亲本RNA均可作为mRNA合成各种蛋白质,包括刺突的糖蛋白、内部蛋白、逆转录酶和转化蛋白等。这种转化蛋白在适当的时候可把宿主细胞转化成肿瘤细胞。
----4.装配(assembly)
----由分别合成好的核酸与蛋白质组合成完整的、新的病毒粒子的过程称为装配。病毒核酸的复制与病毒蛋白质的合成是分开进行的。在动物和植物细胞中,病毒核酸的复制可在细胞质中,也可在细胞核中进行。复制场所主要取决于特定的病毒和宿主。大多数DNA病毒的DNA在细胞核内复制 ,蛋白质在细胞质中合成。合成好的病毒蛋白质再运到细胞核内装配。大多数RNA病毒的核酸复制与蛋白质合成及其装配,均发生在细胞质中。但也有例外,如含DNA的天花病毒,核酸复制 和蛋白质的合成以及装配却与多数RNA病毒一样;而含RNA的烟草花叶病毒却与大多数DNA病毒相同。
----总之,感染真核细胞的病毒,其蛋白质一般都在细胞质中合成,复制好的核酸再被蛋白质衣壳包围,如果是有囊膜的种类,最后在核衣壳外再包以囊膜。如果装配发生在细胞核中,装配后的核衣壳再进入细胞质中。
----关于真核细胞中病毒核酸复制的位置见表4-3。这种情况产生的原因目前还不清楚。
----5.释放(release)
----成熟的病毒粒子从被感染细胞内转移到外界的过程,称为病毒释放。当宿主细胞内的大量子代病毒成熟后,由于水解细胞膜的脂肪酶和水解细胞壁的溶菌酶的作用,从细胞内部促进细胞裂解,从而实现病毒的释放。E.coli的T系噬菌体就是这样释放的。还有一些纤丝状的噬菌体,例如E.coli的f1、fd和M13等,它们的衣壳蛋白在合成后都沉 积在细胞膜上。噬菌体成熟后并不破坏细胞壁,而是一个个噬菌体DNA穿过细胞膜外出时才与 衣壳蛋白结合,然后穿出细胞。在这种情况下,宿主细胞仍可继续生长。动物病毒释放的方式多样,有的通过细胞溶解或局部破裂而释放,裸露的腺病毒和脊髓灰质炎病毒即如此。具囊膜的病毒则通过与吞饮病毒相反的过程——“出芽”作用(图4—6)或细胞排泄作用而释放; 有的沿核周与内质网相通部位从细胞内逐渐释放出来;大部分病毒则留在细胞内,通过细胞之间的接触而扩散。有些植物病毒,如巨细胞病毒,很少释放到细胞外,而是通过胞间连丝或融合细胞在细胞间传播。不管以何种方式释放出来的病毒粒子,均可再行感染。
----这里选用两种不同的病毒核酸的复制模型(图4—7为DNA病毒复制模型,图4—8为RNA病毒复制 模型),说明病毒的增殖过程。
表4-3 动物和植物病毒核酸复制的位置
|
病毒核酸类型 |
细胞核 |
细胞质 |
|
DNA |
疱疹病毒
多型瘤病毒
腺病毒
大多数其他DNA病毒 |
痘类病毒
|
|
RNA |
烟草花叶病毒 |
脊髓灰质炎病毒
大多数其他RNA病毒 |
图4—7 DNA病毒(腺病毒)复制模型
1.吸附； 2.穿入； 3.脱壳，脱出的DNA向核内移动；4.转录mRNA；5.转录“早期蛋白质”；6.复制子代DNA，合成与转录晚期mRNA；7.带有遗传信息的晚期mRNA在细胞质中移动并翻译病毒蛋白质； 8.合成的病毒蛋白质向核内移动； 9.病毒DNA和蛋白质装配形成成熟病毒粒子；10.细胞崩解，病毒释放
图4—8 RNA病毒(脊髓灰质炎病毒)复制模型
1.吸附；2.侵入；3.脱壳；4.初期翻译RNA多聚酶，合成细胞代谢的抑制物；5.形成复制型；6.形成复制中间型；7.形成子代RNA；8.翻译晚期蛋白质(合成病毒蛋白质)；9.子代RNA与病毒蛋白质装配，形成成熟病毒；10.释放(a→a′表示病毒感染后可见到细胞核的变形)
第四节 噬菌体
噬菌体(phage)是侵染细菌和放线菌等细胞型微生物的病毒。广泛分布于自然界。1915年英国人Twort(陶尔特)在培养葡萄球菌时,发现菌落上出现了透明斑。用接种针接触透明斑后再接触另一菌落,不久,被接触的部分又出现了透明斑。1917年,法国人d' Herelle(第赫兰尔)在巴斯德研究所也观察到,向痢疾杆菌的新鲜液体培养物中加入某种污水的无细菌滤液,混浊的培养物变清了。若将此澄清液再行过滤,并加到另一敏感菌株的新鲜培养物中,结果同样变清。以上现象,被称为陶尔特——第赫兰尔现象。第赫兰尔将该溶菌因子命名为噬菌体。1938年以后,人们对其进行了大量研究,而且主要集中于大肠杆菌T-系噬菌体,获得了很多有关病 毒的基础知识。虽然植物病毒在病毒学发展史上曾起过领先的作用,但要从分子水平上深入研究病毒复制增殖、生物合成、基因表达、颗粒装配、感染性以及其他活性等问题,噬菌体却是一个很方便的模型和独特工具,因为它是一个宿主为单细胞的简单寄生物。
一、形态结构
----噬菌体除其有特异性宿主外,与其他病毒并无显著区别。噬菌体共有6类形态(表4— 4)。
表4—4 6类噬菌体的实例
|
类 型 |
E.coli 噬菌体 |
其他细菌的噬菌体 |
|
A |
T2,T4,T6 |
假单胞菌属:12S,PB-1
芽孢杆菌属:SP-50
粘球菌属:MX-1
沙门氏菌属:66t |
|
B |
T1,T2,λ |
假单胞菌属:PB-2
棒杆菌属:B
链霉菌属:K1 |
|
C |
T3,T7 |
假单胞菌属:12B
土壤杆菌属:PR-1001
芽孢杆菌属:GA/1
沙门氏菌属:P22 |
|
D |
ΦX174 |
沙门氏菌属:ΦR |
|
E |
f2,MS2,Qβ |
假单胞菌属:7S,PP7
柄细菌属的某些噬菌体 |
|
F |
fd,f1,M13 |
假单胞菌属的某些噬菌体 |
欠缺！
----在病毒学研究中,E.coli是发现噬菌体最多、研究得最深入的一种宿主,现将它的若干噬菌体的特征列于表4—5。其典型结构见复合对称壳体。
表4—5 某些大肠杆菌噬菌体的特征
|
噬菌体 |
粒子的形态 |
核酸的类型和含量(Da) |
潜伏期(min) |
在37℃下的生长周期 |
|
头 |
尾 |
每一细胞平均产量 |
溶 原 性 |
特 点 |
|
T1
T2,T4,T6
T3,T7
T5
λ,Φ80
P1
P2
ΦX174,S13
f2,MS2
f1,fd
χ*
|
二十面50nm
长二十面体65×95nm
二十面47nm
二十面65nm
二十面54nm
二十面65nm
二十面50nm
二十面30nm
二十面24nm
无
二十面体67.5nm
|
10×150nm
25×110nm
10×15nm
10×170nm
10×140nm
12×150nm
10×150nm
无
无
6×800nm
12.5×230nm
|
DNA,2.5×10~7
DNA,1.2×10~8
DNA,2.4×10~7
DNA,7.5×10~7
DNA,3.3×10~7
DNA,6×10~7
DNA,2.2×10~7
DNA,单链1.7×10~6
DNA,9×10~5
DNA,单链1.3×10~6
DNA
|
13
21～25
13
40
35
45
30
13
22
30
60
|
150
150～400
380
200
100
80
120
180
20 000
100～200
连续释放
200
|
—
—
—
—
+
+
+
—
—
—
—
|
抗干燥
含有葡糖基HMC
产生半温和型突株
DNA分两步注入
DNA在离体或活体内呈环状
普遍转导
多重染色体位点
环状DNA
雄性菌株特异,附着于F菌毛上
雄性菌株特异,环状DNA
附着于运动鞭毛上
|
* 不是E.coli的噬菌体,长在许多沙门氏菌的菌株上。
二、增殖
----根据噬菌体与宿主细胞的关系可将噬菌体分为烈性噬菌体和温和噬菌体两类。烈性噬菌体进入菌体后会改变宿主的性质,使之成为制造噬菌体的“工厂”,大量产生新的噬菌体,最后导致菌体裂解死亡。温和噬菌体进入菌体后,因生长条件不同,可沿两条截然不同的、可选择的途径发展。一条是与烈性噬菌体相同的生长路线,引起宿主细胞裂解死亡;另一条是将其 核酸整合到细菌染色体上,该细菌细胞继续生长繁殖,并被溶原化。
----1.烈性噬菌体
----烈性噬菌体侵入寄主细胞后,按照噬菌体的遗传特性,借寄主细胞的生化机制,行核酸复制和蛋白质合成,形成各部件,再组装成许多子代噬菌体的过程称为增殖。噬菌体的繁殖是以完全不同于细胞生物的复制方式进行的。噬菌体的繁殖是其基因组复制与表达的结果。所以说,病毒的繁殖是在分子水平上进行的。自病毒吸附于细胞开始,到子代病毒从受染细胞释放出来为止的病毒复制全过程称为病毒的复制周期(或称病毒的感染循环)。噬菌体的复制周期依其发生顺序分为5个阶段:吸附、侵入、复制、成熟和释放。实际上噬菌体复制周期中所发生的事件都是相互依赖、互为因果的,且有些事件几乎是同时发生的。将其划分为5个阶段只不过是为了研究的方便而已。
----吸附--噬菌体对宿主细胞的吸附具高度的特异性。噬菌体与寄主细胞混合发生碰撞接触,尾丝散开,固着于胞壁的特异性受点上,有些吸附在鞭毛或伞毛上。一种细菌可被多种噬菌体感染,因为不同的感染噬菌体在同一寄主细菌的不同受点上吸附。
----当敏感细菌发生突变后,则不能被噬菌体吸附而成为对某噬菌体的抗性菌株。生产上常利用 此特性选育抗噬菌体的抗性菌株。噬菌体也可发生变异成为抗性菌株的吸附者。宿主细胞每个受体结构是受细胞核内的遗传性所决定的。
----侵入--噬菌体侵入方式较其他病毒复杂。E.coliT4噬菌体以其尾部吸附到敏感菌表面,将尾丝展开,通过尾部刺突固着于细胞上。尾部的酶水解细胞壁的肽聚 糖 ,使细胞壁产生一小孔,然后尾鞘收缩,将头部的核酸通过中空的尾髓压入细胞内,而蛋白质外 壳则留在细胞外(图4—9)。从吸附到侵入的时间间隔很短,只有几秒至几分钟。
图4-9 噬菌体T4吸附在大肠杆菌细胞壁上并注入DNA
A.未吸附；B、C.尾部附着；D.尾鞘收缩，注入DNA
----复制--噬菌体核酸进入寄主细胞后,发出信息,操纵寄主细胞的代谢机能,以宿主细胞降解物及培养基介质为原料,大量合成子代噬菌体的头部、尾部等部件及核酸等。
----成熟--即组装噬菌体。先是将复制后的核酸聚缩成多角体,头部蛋白质经排列和结晶过程,包围多角体便形成头部;同时,尾部各构件也行组装,然后与头部连接;最后装上尾丝即形成完整的新的噬菌体。装配过程是通过3个独立的装配途径进行的(图4—10)。
图4-10 T偶数噬菌体的装配过程
----释放--成熟的噬菌体粒子,利用水解细胞膜的脂肪酶和水解细胞壁的溶菌酶的作用,从细胞内部促进细胞裂解,从而实现了噬菌体的释放。E.coli的T系噬菌体就是这样释放的。还有一些纤丝状的噬菌体,例如E.coli的f1、fd和M13等,它们的衣壳蛋白在合成后都沉积在细胞膜上,噬菌体成熟后并不破坏细胞壁,而是一个个噬菌体DNA外出穿过细胞膜时才与衣壳蛋白结合,然后穿出细胞。这种情况下,宿主细胞仍可继续生长。噬菌体的 增殖全过程见图4—11。
图4-11 噬菌体的增殖过程示意图
----上述增殖性生活周期是较短的,例如,E.coliT系噬菌体在合适的温度下为15～25min。每一个宿主细胞裂解后所产生的子代噬菌体量称裂解量(burst size)。不同的噬菌体有不同的裂解量。例如,T2约为150,T4约为100,ΦX174约为1000,而f2则可高达10，00 0左右。
----2.温和噬菌体
----温和噬菌体侵入菌体后不立即裂解细菌细胞,而是将其核酸整合到寄主染色体上,行同步复制,随细胞分裂传递给子代,并赋予菌细胞以新的性状。整合到染色体上的噬菌体DNA叫原(前)噬菌体。含原噬菌体的细菌称为溶原性细菌。
----溶原细菌正常繁殖时,绝大多数不发生裂解现象,只有极少数(大约10~-5)溶原细胞中的原噬菌体发生大量复制的现象,并接着成熟为噬菌体粒子,这时导致寄主细胞裂解,这种现象称为溶原细菌的自发裂解。即少数溶原细菌中的温和噬菌体变成了烈性噬菌体。用低剂量的紫外线照射,或其它物理、化学方法处理能导致溶原细胞诱发裂解,使溶原细胞大量溃溶,释放出噬菌体粒子。
----溶原细胞中的原噬菌体消失时变为非溶原性细胞,再也不会发生自然溃溶和诱发溃溶现象,该过程称为溶原细胞的复愈或非溶原化。温和噬菌体侵入寄主细胞后发生的侵染过程见图4—12。
图4-12 噬菌体毒性感染和溶源化示意图
----溶原性细菌具“免疫性”,即从一种溶原菌中释放出的噬菌体不裂解同一种溶原菌。例如含有λ原噬菌体的溶原性细胞,对于λ噬菌体的毒性突变株有免疫性。或者说,毒性突变株对非溶原性宿主细胞有毒性,对溶原性宿主细胞(含λ噬菌体DNA)却没有毒性。其他温和噬菌体对其毒性突变株的免疫关系也是如此。
----λ型噬菌体--λ噬菌体是一种研究得较清楚的大肠杆菌温和噬菌体。λ噬菌体的原噬菌体插入寄主细胞染色体的特定位点上(在lac位点附近),成为寄主细胞染色体的附 体,并随着寄主细胞的复制、繁殖而传代。
----PI型噬菌体--PI噬菌体也是一种温和噬菌体。与λ噬菌体相比,它有两个明显不同的特征。一是它的原噬菌体主要是独立地存在于寄主细胞内,而不是染色体的附加体。二是当它插入染色体为附加体时不是在某个特定位点上,而是在许多不同位点上插入。
三、噬菌体的应用及防治
----由于噬菌体的某些生物学特性,使其在人类的生产实践和生物学基础理论研究中都有一定的价值。
----1.用于鉴定未知细菌
----在医学上,有些病原菌用其他方法很难鉴别,利用噬菌体对宿主细胞的高度专化性和敏感性,不仅可鉴定到菌种,而且可鉴定到菌型。该法对追溯传染来源以及在临床诊断和流行病学调查中均有重要意义。例如在痢疾杆菌的鉴定中已形成了一个新的与血清学方法基本平行的噬菌体分型法。在葡萄球菌感染的流行病学调查中,此法也有一定价值。
----2.用于临床治疗某些传染性疾病
----早在1949年,我国就开始生产痢疾杆菌噬菌体佐剂,以预防和治疗细菌性痢疾。如果将噬菌体制剂与抗生素或者磺胺药物配合应用,则效果更好。
----3.检验植物病原菌
----利用噬菌体可以检验由种子携带的植物病原菌。将种子培养在营养液中,有针对性的定量加入某种病原菌噬菌体,培养一定时间,再应用双层琼脂技术检查。如果噬菌体数目增多,即证明该种子内带有某种病原菌。这是植物检疫部门进行快速检验的手段之一。
----4.测定辐射剂量
----某些噬菌体(如T2)对辐射剂量的反应敏感而精确。在特定条件下,用射线照射噬菌体一定时间,然后通过测定其剩余侵染能力计算出射线的辐射剂量。这是一种很重要的方法,因为它可以直接测定辐射的生物效应,获得用理化方法不能得到的数据。
----5.噬菌体在分子生物学研究中的作用
----噬菌体现已成为进行分子生物学研究的重要工具和较为理想的材料。通过对大肠杆菌噬菌体侵染过程的研究,使遗传学的很多基本问题弄得更清楚了,并为分子生物学提供了具有普遍意义的知识。例如,证明了DNA是遗传物质;病毒的核酸可以整合到宿主细胞的染色体上; 噬菌体可作为转导因子进行遗传转导作用;证明了mRNA的存在以及蛋白质合成中每个氨基酸的三联密码;遗传信息的转录和翻译的某些机制也是通过对噬菌体的研究而了解的。在遗传工程研究中,噬菌体是外源基因的重要载体,在生产和理论研究中也将起到更大的作用,并制备出某些重要产物。譬如可用于制备乙型肝炎疫苗,这对于乙型肝炎的防治有着重要意义 。
----噬菌体也会给人类造成损失,微生物发酵工业常深受其害。例如在抗生素工业、微生物农药 和有机溶剂生产等发酵工业中,普遍存在着噬菌体危害。目前在酿酒工业中也有发现。当发酵过程中污染了噬菌体后,轻者使发酵周期延长,发酵单位(产量)降低,重则造成倒罐,酿成重大损失。噬菌体的危害可以防治。例如控制或杜绝噬菌体赖以生存增殖的环境条件,定期更换菌种;用药物进行防治。但是,最有效的防治措施是：根据菌株和噬菌体的遗传变异规律,选育抗噬菌体的突变株,使敏感菌株转化为具抗性的新菌种。
第五节 亚病毒
前面内容所涉及的病毒皆为经典意义的病毒,即真病毒。它们是一种极为简单的生命形式,然而却不是最简单的生命形式。目前所知的最简单的生命形式是称之为亚病毒的一类生物分子。这些生物分子不具有真病毒的形态结构,能利用非自身编码的酶系统进行复制,有侵染性, 并可在宿主中引起症状。亚病毒主要有类病毒、拟病毒和朊病毒。
一、类病毒
----1971年首次报道,引起马铃薯纺锤形块茎病的病原体是一种裸露的低分子量RNA,没有蛋白质外壳,在其感染的植物组织中未发现有病毒颗粒。这种小分子RNA能在敏感细胞中自我复制, 不需要辅助病毒,可使宿主产生特殊症状。
----类病毒是当今所知道的最小、只含RNA一种成分及专性细胞内寄生的分子生物。现将类病毒的特点及其与病毒的比较列在表4—6中。
表4—6 类病毒的特点及其与病毒的比较
----大量实验证明,马铃薯纺锤形块茎病类病毒(potato spindle tuber viroid,PSTV)呈棒形结构,是一个裸露的闭合环状RNA分子。整个环由两个互补的半体所组成,其中一个半体含179个核苷酸,另一个半体含180个核苷酸,两者间有70%的碱基以氢键方式结合,共形成122个碱基对。整个棒状结构中有27个内环,最大的螺旋分段含有8个碱基对,最大的内环含有12个核苷酸( 图4—13)。
图4-13 马铃薯纺锤形块茎类病毒(PSTV)的结构模型
----类病毒的发现,是生命科学中的一个重大事件。对生物学家来说,类病毒的发现为探索生命起 源提供了一个新的低层次上的好对象;对分子生物学家来说,类病毒是研究最重要生物大分子 结构与功能的绝好材料;对病理学家来说,类病毒的发现为他们揭开人类和动、植物的各种传染性疑难杂症的病因带来了新的希望;对哲学家来说,类病毒的发现,为长期以来有关生命本 质的认识带来革命性的影响。
二、拟病毒
----拟病毒又称类类病毒或病毒的病毒,是一类包裹在植物病毒粒子中的类病毒。它是一些必须依赖辅助病毒才能复制的小分子单链RNA片段,它被包装在辅助病毒的壳体中,本身对于辅助病毒的复制不是必需的,而且它与辅助病毒的基因组无明显的同源性。拟病毒利用辅助病毒的复制酶进行复制，犹如病毒利用宿主细胞的能量、原料及酶进行复制一样。故可认为拟病毒是寄生于辅助病毒粒子中的分子寄生物。
----1981年Randles等在绒毛烟上分离到一种直径为30nm的二十面体病毒,称为绒毛烟斑驳病毒。当他们在鉴定该病毒时,发现其基因组除含一种大分子线状ssRNA(称RNA-1)外,还含有一种类似于类病毒的环状ssRNA分子(称RNA-2)及它的线状形式(称RNA-3)。进一步研究表明对该病毒的RNA-1和RNA-2进行单独接种时,都不能感染和复制,只有把两者合在一起时才可以感染和复制。因此,这种环状ssRNA分子(RNA-2)是一种类似于类病毒的新型RNA分子,于是Haseloff 等(1982)将这种包被于病毒衣壳内的环状RNA分子称为拟病毒。至1986年,已发现的拟病毒除 绒毛烟斑驳病毒外,还有苜蓿暂时性条斑病毒、莨菪斑驳病毒和地下三叶草斑驳病毒。现将它们的核酸和蛋白质组成列在表4—7中。
表4—7 含有拟病毒RNA的四种病毒的蛋白质和核酸组成
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
RNA-1
分子量(Da)
RNA-2
分子量(Da)
碱基数 |
单链,线状
1.5×10~6
单链,环状0.12×10~6
366 |
单链,线状
1.5×10~6
单链,环状
0.12×10~6
377 |
单链,线状
1.4×10~6
单链,环状0.12×10~6
324 |
单链,线状
1.5×10~6
单链,环状0.12×10~6
400或300* |
*RNA-2约含400个核苷酸,RNA-3约含300个核苷酸。
----关于拟病毒的复制机制,目前还只有很少的研究结果。据推测,拟病毒的复制是以自身侵染性RNA分子为模板,借助宿主细胞内依赖于RNA的RNA聚合酶进行复制。具体过程为:先以滚环方式合成一条高分子量多拷贝的负链RNA,再以负链为模板合成一系列的正链RNA,于是形成了一 个双链的复制中间体,然后再从复制中间体上产生线状的ssRNA-3分子,RNA-3再在RNA连接酶 的作用下环化成RNA-2这种拟病毒分子(图4—14)。
图4-14 拟病毒RNA复制的滚环模型
----拟病毒的研究至少有以下4个方面的意义:①有助于探索核酸的结构与功能。拟病毒是一种低分子量的侵染性核酸分子,因而易于进行细致的化学组分和结构分析;通过拟病毒与类病毒的结构与功能的比较,对核酸的结构与功能可能会得到更深入的了解;②有助于探索拟病毒与辅助病毒(RNA-1)间的相互关系。拟病毒必须依靠辅助病毒的存在才能复制,而辅助病毒的复制却不需要拟病毒的存在。拟病毒的存在可以影响辅助病毒的产量和改变辅助病毒在宿主上的症状及反应的程度;③利用拟病毒这类低分子RNA来组建新的弱毒疫苗。拟病毒又可称类类病毒,它与普通类病毒的差异在于它的侵染对象不是高等植物或动物,而是小小的植物病毒。根据拟病毒的存在可影响辅助病毒的产量和改变辅助病毒在宿主上的症状和反应程度的原理,有可能用它来人工组建具有防病功能的弱化疫苗;④对拟病毒的深入研究,也有助于进一步探索病毒的本质和生命起源等重大生物学理论问题。
三、朊病毒
----朊病毒(prion, virino)又称“普列昂”或蛋白质侵染因子(prion原是protein infection 的缩写)。据目前所知,朊病毒是一类能侵染动物并在宿主细胞内复制的小分子无免疫性疏水蛋白质。
----羊搔痒病是绵羊和山羊的一种中枢神经系统退化性紊乱疾病,具有脱毛、皮肤搔痒、失去平衡和后肢麻痹等症状。其病原是经过近两个世纪的研究仍未解决的一个谜。自从发现类病毒后,人们就联想起动物中亦有相应类病毒存在的可能。1982年,美国的S.B.Prusiner终于发现羊搔痒病的病原是一种蛋白质,称为朊病毒。这一发现在生物学界引起震惊,因为它与目前公认的“中心法则”即生物遗传信息流的方向是“DNA→RNA→蛋白质”的传统观念发生抵触, 因而有可能为分子生物学的发展带来革命性的影响,同时还有可能为弄清一系列疑难传染性疾病的病原带来新的希望。
----有关朊病毒的化学本质及其与类病毒的比较见表4—8。
表4—8 朊病毒与类病毒在化学特性上的比较
|
处理因素及其浓度 |
类病毒(PSTV) |
朊病毒 |
|
RNA酶A(0.1～100μg/ml) |
+ |
- |
|
RNA酶(100μg/ml) |
- |
- |
|
蛋白酶K(100μg/ml) |
- |
+ |
|
胰蛋白酶(100μg/ml) |
- |
+ |
|
碳酸二乙酯(10～20mmol/L) |
[-] |
+ |
|
羟胺(0.1～0.5mmol/L) |
+ |
- |
|
补骨脂素*(10～500μg/ml) |
+ |
- |
|
苯酚(饱和溶液) |
- |
+ |
|
SDS**(1～10%) |
- |
+ |
|
Zn2+(2mmol/L) |
+ |
- |
|
尿素(3～8mmol/L) |
- |
+ |
|
碱(pH=10) |
[-] |
+ |
|
硫氰酸钾(KSCN，1mol/L) |
- |
+ |
*补骨脂素(psoralen) 是一种能侵入病毒衣壳内与其核酸起光化反应以阻止其复制的化合物。
**SDS为十二烷基硫酸钠。
表中+、-及［-］分别表示各处理因素对两类病毒的活性有影响、无影响及有微弱影响
----从表4—7中可以看出，对朊病毒影响最大的都是一些蛋白酶、氨基酸化学修饰剂(碳酸二乙酯)和蛋白质变性剂(尿素、苯酚、KSCN、SDS)等。实验还证明，对侵染仓鼠脑的朊病毒作进一步提纯后，发现蛋白质纯度越高，则其比侵染性(ID50单位即半数感染剂量，每毫克蛋白质)也越强。经测定，朊病毒的分子量为27，000～30，000Da。
----朊病毒在电子显微镜下呈杆状颗粒，直径25nm，长100～200nm(一般为125～150nm)。杆状颗 粒不单独存在，总是呈丛状排列，每丛大小和形状不一，多时可含100个。
----有关朊病毒的本质至今还有不同的看法，只有依靠进一步改进实验手段和通过深入的研究才有可能作出可靠的结论。至于其复制机制当前虽有各种实验和推测，但距最终解决还有一定的距离。
|
